学校疫情中诺如病毒的双重荧光数字PCR定量检测方法

摘要/Abstract

摘要：

目的建立一种适用于学校诺如病毒（GⅠ和GⅡ）聚集性疫情检测的双重荧光逆转录微滴数字聚合酶链式反应（reverse transcription-droplet digital polymerase chain reaction，RT-ddPCR）定量检测方法。方法根据学校诺如病毒疫情的样品，选定引物、探针，优化反应体系，确定合适的退火温度和检测范围，建立诺如病毒双重荧光RT-ddPCR定量检测方法。结果诺如病毒双重荧光RT-ddPCR定量检测方法退火温度为58 ℃，检测方法线性范围均为5.0~1.0×10⁴ copies/μL，相关系数（r）0.998，检出限为2.0 copies/μL，定量限为5.0 copies/μL，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.1%~21.5%。结论本研究建立的诺如病毒双重荧光逆转录微滴数字PCR定量检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测限低等优点，适用于学校诺如病毒（GⅠ和GⅡ）疫情的定量检测。

关键词: 数字聚合酶链式反应, 诺如病毒, 定量检测, 学校

Abstract:

Objective To establish a dual-fluorescence reverse transcription droplet digital polymerase chain reaction（RT-ddPCR） quantitative detection method for the epidemic determination of Norovirus（GⅠ and GⅡ） outbreaks in schools. Methods Based on the samples of the Norovirus epidemic in schools，primers and probes were selected，the reaction system was optimized，the appropriate annealing temperature and detection range were determined，and a dual fluorescence RT-ddPCR quantitative detection method for Norovirus was established. Results The annealing temperature of the method was 58 ℃ with a linear range of 5.0-1.0×10⁴ copies/μL. The correlation coefficient was 0.998，the limit of detection was 2.0 copies/μL，the limit of quantification was 5.0 copies/μL，and the relative standard deviation（RSD） was 2.1%-21.5%. Conclusion The RT-ddPCR quantitative detection method for the Norovirus has the advantages of strong specificity，high sensitivity and low detection limit，which is suitable for the quantitative determination of Norovirus（GⅠ and GⅡ） epidemic in schools.

Key words: Digital PCR, Norovirus, Quantitative detection, School

中图分类号:

R115

冯耀基, 苏彦, 苏文章, 罗琳, 邓洁琳. 学校疫情中诺如病毒的双重荧光数字PCR定量检测方法. [J]职业与健康, 2026, 42(15): 2043-2047.

FENG Yaoji, SU Yan, SU Wenzhang, LUO Lin, DENG Jielin. Quantitative detection of Noroviruses in school epidemic by dual fluorescence digital PCR. [J]OCCUPATION AND HEALTH, 2026, 42(15): 2043-2047.

图/表 12

参考文献 24

[1]	梁丹, 车荣飞, 石倩萍, 等. 感染性腹泻疾病负担及其病原谱变化研究进展[J]. 中国公共卫生, 2020, 36(11):1651-1654.
[2]	Centers for Disease Control and Prevention. Updated norovirus outbreak management and disease prevention guidelines[EB/OL].(2011-03-04)[2017-05-15].https//cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr6003a1.htm.
[3]	徐勇, 唐烊阳, 杨璐琪, 等. 2010—2022年内江市其他感染性腹泻流行特征及疾病负担研究[J]. 预防医学情报杂志, 2024, 40(6):643-651.
[4]	朱曦, 靳淼, 段招军. 诺如病毒流行病学及疾病负担研究进展[J]. 疾病监测, 2021, 36(8):769-773.
[5]	赵秀昌, 黄泽黄. 我国诺如病毒流行及疾病负担研究进展[J]. 内科, 2023, 18(3):262-265.
[6]	廖巧红, 冉陆, 靳淼, 等. 诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南(2015版)[J]. 传染病专报, 2015, 3(37):1-44.
[7]	连怡遥, 骆洪梅, 冉陆, 等. 中国2014—2018年学校和托幼机构诺如病毒疫情流行病学分析[J]. 中国学校卫生, 2019, 40(3):406-410.
[8]	任婧寰, 王锐. 2017—2021年我国其他感染性腹泻突发公共卫生事件流行特征分析[J]. 热带病与寄生虫学, 2023, 21(1):1-6,29.
[9]	曾云婷, 陈海云, 李丹丹, 等. 2020—2022年海南省诺如病毒胃肠炎暴发疫情分子流行特征分析[J]. 安徽医科大学学报, 2024, 59(2):336-343.
[10]	张强, 曾臻, 桑燕茹, 等. 2018—2022年合肥市学校诺如病毒感染疫情特征分析[J]. 中国感染控制杂志, 2024, 23(42):1508-1513.
[11]	朱曦, 孔翔羽, 章青, 等. 2016—2019年我国诺如病毒暴发疫情的分子流行病学特征分析[J]. 疾病监测, 2021, 36(8):774-779.
[12]	钟秀茵, 黄艳萍, 卓章鹏, 等. 2022至2023年度黄埔区腹泻儿童诺如病毒感染及基因型的研究[J]. 当代医药论丛, 2024, 22(14):92-95.
[13]	张玲玲, 宋士利, 韩荣荣, 等. 杭州市临平区2013—2023年诺如病毒感染性腹泻监测分析[J]. 中国乡村医药, 2024, 31(20):1-3.
[14]	陈嘉茵, 方苓, 吴诗微, 等. 一步法微滴数字PCR检测生菜中GII型诺如病毒[J]. 食品科学, 2019, 40(4):332-337.
[15]	周阳, 栾军, 蒋鲁岩, 等. 实时荧光RT-PCR检测冷冻草莓中诺如病毒[J]. 食品安全质量检测学报, 2013, 4(2):515-520.
[16]	徐文斐, 房保海, 林超, 等. 抑制剂去除对冷冻草莓中诺如病毒RT-PCR检测的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(4):296-300.
[17]	LOISY F, ATMAR R L, GUILLON P, et al. Real-time RT-PCR fornorovirus screening in shellfish[J]. J Virol Methods, 2005, 123(1):1-7.
[18]	KAGEYAMA T, KOJIMA S, SHINOHARA M, et al. Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(4):1548-1557.
[19]	冯秀晶, 易红梅, 任星旭, 等. 数字PCR技术及其在检测领域的应用[J]. 遗传, 2020, 42(4):363-373.
[20]	曲瑶, 张皓博, 刘蒙达, 等. 多重数字PCR及其在疾病检测中的研究进展[J]. 中国动物检疫, 2023, 40(10):74-81.
[21]	国家认证认可监督管理委员会. 基因扩增检测方法确认与验证指南:RB/T 032—2020[S]. 北京: 中国标准出版社,2020:5.
[22]	冯兆民, 赵翔, 邹晓辉, 等. 基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法的建立及应用[J]. 病毒学报, 2017, 33(1):1-5.
[23]	廖巧红, 冉陆, 靳淼, 等. 诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南(2015版)[J]. 中国病毒病杂志, 2015, 5(6):448-458.
[24]	HENRICH T J, GALLIEN S, LI J Z, et al. Low-level detection and quantitation of cellular HIV-1 DNA and 2-LTR circles using droplet digital PCR[J]. Virol Methods, 2012, 186(1):68-72.

病毒名称	引物和探针序列（方向5'-3'）	扩增片段大小（bp）	参考毒株基因序列号及扩增基因位置
GⅠ型NV	COG1-F：GCARGCCATGTTCCGCTG	102	GenBank登录号：OP7462279.1，（186~287）
	COG1-R：CGTCCTTAGACGCCATCATCATT
	RING1-P：CGRTCTCCTGTCCACA
GⅡ型NV	COG2-F：CMATGTHCAGRTGGATGAGRTTYTC	91	GenBank登录号：OP309633.1，（191~281）
	COG2-R：TMGACGCCATCYTCATTCACR
	RING2-P：ATCGCAATCTKGCTCC

病毒名称	引物和探针序列（方向5'-3'）	扩增片段大小（bp）	参考毒株基因序列号及扩增基因位置
GⅠ型NV	COG1-F：GCARGCCATGTTCCGCTG	102	GenBank登录号：OP7462279.1，（186~287）
	COG1-R：CGTCCTTAGACGCCATCATCATT
	RING1-P：CGRTCTCCTGTCCACA
GⅡ型NV	COG2-F：CMATGTHCAGRTGGATGAGRTTYTC	91	GenBank登录号：OP309633.1，（191~281）
	COG2-R：TMGACGCCATCYTCATTCACR
	RING2-P：ATCGCAATCTKGCTCC

序号	理论浓度（copies/μL）	平行检测（copies/μL）			平均值（copies/μL）	RSD （%）
序号	理论浓度（copies/μL）	1	2	3	平均值（copies/μL）	RSD （%）
1	10 000.0	9 381.0	9 167.8	9 589.5	9 379.4	2.248
2	5 000.0	4 626.0	4 439.5	3 896.0	4 320.5	8.778
3	1 000.0	961.3	1 053.8	1 087.8	1 034.3	6.330
4	100.0	78.8	74.5	71.0	74.8	5.192
5	10.0	9.5	7.3	7.5	8.1	15.256
6	5.0	7.1	4.6	6.2	6.0	21.976
7	2.0	2.2	0.9	2.0	1.7	41.176

序号	理论浓度（copies/μL）	平行检测（copies/μL）			平均值（copies/μL）	RSD （%）
序号	理论浓度（copies/μL）	1	2	3	平均值（copies/μL）	RSD （%）
1	10 000.0	9 381.0	9 167.8	9 589.5	9 379.4	2.248
2	5 000.0	4 626.0	4 439.5	3 896.0	4 320.5	8.778
3	1 000.0	961.3	1 053.8	1 087.8	1 034.3	6.330
4	100.0	78.8	74.5	71.0	74.8	5.192
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7	2.0	2.2	0.9	2.0	1.7	41.176

序号	理论浓度（copies/μL）	平行检测（copies/μL）			平均值（copies/μL）	RSD （%）
序号	理论浓度（copies/μL）	1	2	3	平均值（copies/μL）	RSD （%）
1	10 000.0	9 587.8	8 968.0	10 129.5	9 561.8	6.078
2	5 000.0	4 410.5	4 803.8	4 061.3	4 425.2	8.394
3	1 000.0	1 043.3	931.3	1 103.8	1 026.1	8.530
4	100.0	64.8	71.8	66.8	67.8	5.322
5	10.0	9.8	6.9	8.4	8.3	17.555
6	5.0	6.6	4.4	6.8	5.9	22.890
7	2.0	1.6	1.2	2.3	1.7	32.752