母乳中10种四环素类抗生素及其代谢物超高效液相色谱-串联质谱的同时测定法

摘要/Abstract

摘要：

目的建立同时测定母乳中二甲胺四环素、土霉素、四环素等10种四环素类抗生素及其代谢物的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱方法。方法母乳样品经pH 4.0±0.5的Na₂EDTA-Mcellvaine缓冲液提取后采用HLB固相萃取小柱进行净化，洗脱液经氮气吹干后用流动相复溶，经Acquity UPLC BEH C₁₈色谱柱分离，使用电喷雾离子源（electric spray ion source，ESI）正离子模式和多反应监测（multi-reaction monitoring，MRM）进行检测，基质曲线法定量。结果 10种四环素类抗生素及其代谢物在定量限~22.5 μg/kg范围内呈良好的线性关系，相关系数均≥0.998，检出限为0.011~0.210 μg/kg，定量限在0.036~0.700 μg/kg，加标回收率为70.7%~118.0%，精密度为2.01%~11.70%。结论该方法灵敏、快速、准确，适用于大人群母乳样本中四环素类抗生素及其代谢物含量的检测。

关键词: 超高效液相色谱-串联质谱法, 固相萃取, 母乳, 四环素, 代谢产物

Abstract:

Objective To establish an ultra-high performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry（UHPLC-MS/MS） method for the simultaneous determination of 10 tetracycline antibiotics and their metabolites（including minocycline， oxytetracycline，tetracycline，etc.） in breast milk. Methods Breast milk samples were extracted with Na₂EDTA-Mcllvaine buffer（pH 4.0±0.5），purified using HLB solid-phase extraction（SPE） cartridges，and then reconstituted in mobile phase after nitrogen drying. Separation was performed on an Acquity UPLC BEH C₁₈ column，followed by detection in electrospray positive ionization mode（ESI⁺） with multiple reaction monitoring（MRM）. Quantification was achieved using matrix-matched calibration curves. Results The method demonstrated a good linearity for all 10 tetracyclines and their metabolites in the range of LOQ-22.5 μg/kg，with correlation coefficients（r）≥0.998. The limits of detection（LODs） ranged from 0.011 to 0.210 μg/kg，and the limits of quantification（LOQs） ranged from 0.036 to 0.700 μg/kg. The recoveries at spiked levels were 70.7%-118.0%，with precision between 2.01% and 11.70%. Conclusion This method is sensitive，rapid，and accurate，suitable for detecting of tetracycline antibiotics and their metabolites in breast milk samples of large-scale.

Key words: Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Solid phase extraction, Breast milk, Tetracycline, Metabolites

中图分类号:

R115

徐斯琦, 赖淼菊, 崔淑丹, 李强. 母乳中10种四环素类抗生素及其代谢物超高效液相色谱-串联质谱的同时测定法. [J]职业与健康, 2026, 42(5): 614-619.

XU Siqi, LAI Miaoju, CUI Shudan, LI Qiang. Simultaneous determination of 10 tetracycline antibiotics and their metabolites in breast milk by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. [J]OCCUPATION AND HEALTH, 2026, 42(5): 614-619.

图/表 8

参考文献 25

[1]	LAI X, LIU J, XU X, et al. Ultrasensitive high-performance liquid chromatography determination of tetracycline antibiotics and their 4-epimer derivatives based on dual effect of methanesulfonic acid[J]. J Sep Sci, 2020, 43(2):398-405. DOI PMID
[2]	LEICHTWEIS J, VIEIRA Y, WELTER N, et al. A review of the occurrence,disposal,determination,toxicity and remediation technologies of the tetracycline antibiotic[J]. Process Saf Environ, 2022,160:25-40.
[3]	UDALOVA A Y, DMITRIENKO S G, APYARI V V. Methods for the separation,preconcentration,and determination of tetracycline antibiotics[J]. J Anal Chem, 2015, 70(6):661-676. DOI URL
[4]	LYU F, YU H, HOU T, et al. Efficient and fast removal of Pb²⁺ and Cd²⁺ from an aqueous solution using a chitosan/Mg-Al-layered double hydroxide nanocomposite[J]. J Colloid Interface Sci, 2019,539:184-193.
[5]	李佩佩, 张小军, 严忠雍, 等. 超高效液相色谱串联质谱法检测水产品中四环素类药物及其差向异构体[J]. 中国食品学报, 2019, 19(7):275-282.
[6]	赖晓静. 等度洗脱HPLC法灵敏检测四环素类抗生素及其差向异构体的研究[D]. 南昌: 南昌大学医学部, 2018.
[7]	LYU J, YANG L, ZHANG L, et al. Antibiotics in soil and water in China-a systematic review and source analysis[J]. Environ Pollut, 2020, 266(Pt1):115147. DOI URL
[8]	中华人民共和国农业农村部. 2018年中国兽用抗菌药使用情况报告2029年第8期兽医公报[EB/OL].(2019-11-01)[2024-12-28]. http://www.moa.gov.cn/gk/sygb/201911/P020191108590803635472.pdf.
[9]	中华人民共和国农业农村部. 2019年中国兽用抗菌药使用情况报告2020年第10期兽医公报[EB/OL].(2020-12-24)[2024-12-28]. https://www.moa.gov.cn/gk/sygb/202012/P020201214509059672681.pdf.
[10]	中华人民共和国农业农村部. 2020年中国兽用抗菌药使用情况报告2021年第9期兽医公报[EB/OL].(2021-11-04)[2024-12-28]. http://www.moa.gov.cn/gk/sygb/202111/P020211104353940540082.pdf.
[11]	ALIABADI T, SABERI E A, TABATABAIE A M, et al. Antibiotic use in endodontic treatment during pregnancy:A narrative review[J]. Eur J Transl Myol, 2022, 32(4):10813.
[12]	李曼玉, 尹婕, 马良坤. 长期低剂量抗生素的暴露对孕妇及婴幼儿的影响[J]. 基础医学与临床, 2020, 40(2):253-256.
[13]	栗慧, 李佳仪, 彭伟. 四环素类抗生素检测方法研究进展[J]. 河北北方学院学报(自然科学版), 2018, 34(2):41-45,48.
[14]	邵钰秀, 余云娟, 肖晶, 等. 电堆积毛细管电泳法检测食品中四环素类抗生素残留[J]. 河北大学学报(自然科学版), 2013, 33(2):161-166. DOI
[15]	沈虎琴, 檀华蓉, 祁克宗, 等. 高效毛细管电泳法同时分离氟喹诺酮类与四环素类药物的研究[J]. 安徽农业大学学报, 2012, 39(2):207-210.
[16]	MU G, LIU H, XU L, et al. Matrix solid-phase dispersion extraction and capillary electrophoresis determination of tetracycline residues in milk[J]. Food Anal Methods, 2012, 5(1):148-153. DOI URL
[17]	刘紫薇, 张雨, 倪兰秀, 等. 基于光学分析法的抗生素检测研究进展[J]. 环境化学, 2024, 43(12):3990-4000.
[18]	IRANIFAM M, KHABBAZ KHARAMEH M. Cupric oxide nanoparticles-enhanced chemiluminescence method for measurement of β-lactam antibiotics[J]. Luminescence, 2015, 30(5):625-630. DOI PMID
[19]	SHOKRI R, AMJADI M. Boron and nitrogen co-doped carbon dots as a chemiluminescence probe for sensitive assay of rifampicin[J]. J Photoch Photobio A, 2022,425:2-7.
[20]	SOHEE J, INSOOK R P. Sensitivity and selectivity on aptamer-based assay:The determination of tetracycline residue in bovine milk[J]. Sci World J, 2012,1:159456.
[21]	徐新, 孙文芳, 徐杰, 等. 固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定人尿液中40种抗生素的残留量[J]. 理化检验(化学分册), 2023, 59(5):591-598.
[22]	程岁寒, 潘存锋, 张彦. 高效液相色谱法在兽用抗生素残留分析中的应用[J]. 国外医药(抗生素分册), 2019, 40(1):37-41.
[23]	贾西文. UPLC-MS/MS检测四环素类抗生素及其差向异构体的新方法和前处理材料研究[D]. 南昌: 南昌大学医学部, 2023.
[24]	韩红兴. 4-差向土霉素对大鼠的毒性及其肠道菌群与代谢组学影响的研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2016.
[25]	BÉRDY J. Thoughts and facts about antibiotics:Where we are now and where we are heading[J]. J Antibiot, 2012. 65(8):385-395. DOI

化合物名称	保留时间（min）	母离子（m/z）	子离子（m/z）	碰撞能量（eV）	去簇电压（V）
土霉素	3.60	461.1	426.0^a/443.1	27/17	50
4-差向土霉素	3.38	460.9	426.1^a/444.0	29/23	60
金霉素	5.06	479.0	444.2^a/462.1	27/22	35
差向金霉素	4.46	479.2	444.0^a/462.1	31/22	70
四环素	3.64	445.1	410.1^a/427.0	27/18	20
差向四环素	3.14	445.1	410.0^a/427.2	26/16	23
二甲胺四环素	3.11	458.1	441.0^a/351.8	28/42	45/30
强力霉素	5.89	445.2	427.9^a/410.0	24/36	20
甲烯土霉素	5.61	443.1	426.1^a/381.1	25/31	30
去甲基金霉素	4.27	465.1	430.0^a/448.0	31/25	70

化合物名称	保留时间（min）	母离子（m/z）	子离子（m/z）	碰撞能量（eV）	去簇电压（V）
土霉素	3.60	461.1	426.0^a/443.1	27/17	50
4-差向土霉素	3.38	460.9	426.1^a/444.0	29/23	60
金霉素	5.06	479.0	444.2^a/462.1	27/22	35
差向金霉素	4.46	479.2	444.0^a/462.1	31/22	70
四环素	3.64	445.1	410.1^a/427.0	27/18	20
差向四环素	3.14	445.1	410.0^a/427.2	26/16	23
二甲胺四环素	3.11	458.1	441.0^a/351.8	28/42	45/30
强力霉素	5.89	445.2	427.9^a/410.0	24/36	20
甲烯土霉素	5.61	443.1	426.1^a/381.1	25/31	30
去甲基金霉素	4.27	465.1	430.0^a/448.0	31/25	70

化合物名称	HLB柱回收率（%）	C₁₈柱回收率（%）
土霉素	92.7	75.7
4-差向土霉素	89.1	72.4
金霉素	107.4	80.6
差向金霉素	96.6	63.6
四环素	98.9	69.2
差向四环素	94.6	77.3
二甲胺四环素	95.6	12.8
强力霉素	68.2	43.6
甲烯土霉素	74.1	52.3
去甲基金霉素	76.5	46.3

化合物名称	HLB柱回收率（%）	C₁₈柱回收率（%）
土霉素	92.7	75.7
4-差向土霉素	89.1	72.4
金霉素	107.4	80.6
差向金霉素	96.6	63.6
四环素	98.9	69.2
差向四环素	94.6	77.3
二甲胺四环素	95.6	12.8
强力霉素	68.2	43.6
甲烯土霉素	74.1	52.3
去甲基金霉素	76.5	46.3

化合物名称	纯甲醇（%）	甲醇+乙酸乙酯（2+8，V/V）（%）	含0.1%（V/V）甲酸的甲醇（%）
二水土霉素	92.7	67.2	83.9
4-差向土霉素	89.1	52.7	71.6
金霉素	107.4	94.2	93.4
差向金霉素	96.6	68.9	101.0
四环素	98.9	68.1	73.2
四环素盐酸盐	94.6	78.6	96.9
二甲胺四环素	95.6	56.2	46.2
强力霉素	68.2	69.2	67.7
甲烯土霉素	74.1	80.3	78.6
去甲基金霉素盐酸盐	76.5	59.9	50.5